Одним из самых распространенных инструментов современной диагностики является ультразвуковая (УЗД или УЗИ). Данный метод позволяет рассмотреть внутренние органы человека, оценить их структурное и морфологические особенности и выявить те или иные отклонения. Недооценивать важность УЗИ невозможно, но стоит отметить не безграничность его возможностей. Сосудистая или клеточная структуры остаются вне поля зрения УЗИ, по крайней мере, так было раньше. Ученые из Делфтского технического университета (Делфт, Нидерланды) разработали новый метод микроскопии на основе ультразвука. Из чего состоит новая система, как именно она работает, и что позволяет увидеть? Ответы на эти вопросы мы найдем в докладе ученых.
Основа исследования
Наиболее информативным методом наблюдения динамических клеточных процессов in vivo в трехмерном пространстве является микроскопия светового листа, которая использует генетически кодированные флуоресцентные репортеры. Последовательные достижения в микроскопии светового листа теперь позволяют быстро, в больших объемах и с высоким разрешением получать изображения флуоресцентно меченых клеток в прозрачных или очищенных организмах. Эти возможности оказали огромное влияние на биологию развития, обеспечив долгосрочную визуализацию эмбриогенеза.
Следующим рубежом станет достижение нетоксичной визуализации глубоких тканей с клеточной точностью в живых непрозрачных организмах. К сожалению, ограничения, присущие оптической микроскопии (глубина проникновения < 1 мм и фототоксичность), препятствуют крупномасштабной визуализации в непрозрачных тканях. Кроме того, быстрая визуализация светового листа пока не достигает объемных скоростей 1 мм3/с в живой ткани, что делает динамическую визуализацию в мезомасштабе технически сложной.
Введение биогенных газовых везикул (GV от gas vesicle) в качестве «зеленого флуоресцентного белка для ультразвука» обеспечивает альтернативу свету для крупномасштабной клеточной визуализации. Удачная физика ультразвука позволяет проводить сантиметровое глубинное сканирование тканей млекопитающих, в то время как генетически закодированные GV могут связывать ультразвуковые волны с клеточной функцией. Чтобы раскрыть потенциал акустических репортерных генов (ARG от acoustic reporter gene) на основе GV и биосенсоров, необходимы методы ультразвуковой визуализации с высоким содержанием информации, разрешением, охватом и транслируемостью. В последнее время функциональная ультразвуковая 4D нейровизуализация и 3D ультразвуковая локализационная микроскопия позиционировали ультразвук как инструмент для фундаментальных биологических исследований. Однако по-прежнему невозможно визуализировать клеточную функцию в трех измерениях или обнаруживать капиллярные сети.
В рассматриваемом нами сегодня труде ученые представили нелинейную звуковую листовую микроскопию (NSSM от nonlinear sound-sheet microscopy), метод визуализации целевых биологических функций в см3 непрозрачной живой ткани. NSSM опирается на большое поле зрения, высокочастотную адресную решетку преобразователей строк и столбцов (RCA от row-column addressed) и передачу недифрагирующих ультразвуковых лучей для обнаружения клеток, помеченных GV, или сосудов, помеченных микропузырьками (MB от microbubble). NSSM расширяет поле зрения биомолекулярного ультразвука на частоте 15 МГц с ~3.5 x 64 x 100 λ3 до 80 x 80 x 100 λ3 (где λ обозначает длину волны ультразвука), верхнюю границу скорости 2D-визуализации с 400 Гц до 25.6 кГц и пространственное разрешение с 1 x 1 x 3.5 λ3 до 1 x 1 x 0.6 λ3. Универсальность NSSM была продемонстрирована выполнением объемной визуализации экспрессии генов в модели рака и нелинейным акустическим секционированием живой церебральной сосудистой сети вплоть до капиллярного масштаба. На протяжении всего исследования NSSM сравнивался с линейной визуализацией в качестве референса.
Концепция NSSM
Изображение №1
В парадигме NSSM субапертура элементов RCA-преобразователя Nap (1A) используется для передачи перекрестно распространяющихся ультразвуковых плоских волн или X-волн из двух соседних полуапертур под углами α и −α (1B). Эта пространственно структурированная ультразвуковая передача приводит к возникновению недифракционного поля акустического давления в плоскости XZ, демонстрирующего двойное акустическое давление вдоль главного лепестка луча, и плосковолнового акустического поля давления в плоскости YZ (1C).
Акустическое давление далее модулируется вдоль главного лепестка недифракционного луча с использованием последовательности импульсов перекрестной амплитудной модуляции (xAM от cross amplitude modulation) (1D), которая ограничивает нелинейное рассеяние тонким звуковым листом с постоянной шириной луча независимо от глубины (1E). Звуковой листовой луч простирается до глубины перекрестного распространения zcp = Nap / 2, которая обычно составляет порядка 100λ. 2D-изображения реконструируются из отраженных ультразвуковых эхо-сигналов, полученных на элементах ортогональной решетки RCA (1B), с использованием алгоритма формирования луча с задержкой и суммой.
Функции рассеяния точки (PSF от point spread function) резонансных MB сообщаются (1F) для линейной визуализации или SSM (т. е. только передача TX1) и NSSM (т. е. передачи TX1-TX2-TX3). Ученые выбрали MB в качестве нелинейных точечных целей при моделировании, а не GV, поскольку известны уравнения, регулирующие их вибрацию в ультразвуковом поле. Изображения SSM и NSSM в плоскости XZ показали схожие PSF, поскольку оба режима визуализации работают на одной и той же частоте (1G).
Для сканирования объема передачи звукового листа электронно перемещаются вдоль двух массивов RCA-преобразователя с использованием скользящей апертуры элементов (1H). Точность микросканирования (λ/2) достигается путем чередования передач с и без бесшумного элемента в центре субапертуры (1H), поскольку шаг (p) или межэлементное расстояние RCA приблизительно равно λ. 3D PSF представлены на 1I.
Было показано, что нелинейная визуализация снижает уровни вторичных лепестков 3D PSF на 12.8 дБ ± 4.4 дБ благодаря ограничению нелинейного рассеяния MB плоскостью звукового листа. С точки зрения разрешения, NSSM предоставил среднюю 3D функцию рассеяния точки 1λ х 0.6λ х 0.6λ по сравнению с 1λ х 0.9λ х 0.9λ для SSM (1J).
Результаты исследования
Изображение №2
Нелинейная ультразвуковая визуализация является ключом к обнаружению GV в контексте ткани с высокой специфичностью. Чтобы проверить способность NSSM визуализировать генетическую экспрессию в 3D, ученые сначала визуализировали GV, адаптированные как нелинейные бактериальные ARG (изображение №2). GV Anabaena flos aquae очистили и внедрили их в акустически прозрачные фантомы в концентрациях в диапазоне оптических плотностей (OD от optical density) при 500 нм от 0.5 до 2, тем самым имитируя повышение уровней экспрессии в клетках (2A). Фантом был отсканирован с помощью ортогональной последовательности NSSM с использованием шага сканирования 55 мкм. SSM обнаружила скважины GV при всех концентрациях (2B) и нормализованные отношения контрастности к шуму (CNR от contrast-to-noise ratio), масштабированные с шагом 6.9 дБ в среднем от -20.8 дБ для OD 0.5 до 0 дБ для OD 2. NSSM также обнаружила скважины GV при всех концентрациях (2C) и продемонстрировала больший динамический диапазон в 33 дБ между скважиной GV при OD 0.5 и скважиной GV при OD 2. Наблюдалось меньшее увеличение CNR от OD 1.5 до OD 2, что может быть связано с затуханием ультразвука, зависящим от давления, в среде, содержащей изгибающиеся GV.
Далее ученые проверили способность NSSM визуализировать экспрессию бактериального ARG, что представляет особый интерес для области инженерных бактериальных биосенсоров и терапевтических средств. Были использованы два разных штамма E. coli, контрольный штамм и штамм, трансфицированный плазмидой pBAD-bARGSer, что приводит к внутриклеточной продукции Serratia GV, которые конститутивно производят нелинейное рассеяние (2D). Оба штамма бактерий были помещены в агаровые фантомы и визуализированы с помощью NSSM (2E). Объемы визуализации 8.8 x 8.8 x 10 мм3 были реконструированы из 108 положений сканирования звуковых листов RCA-преобразователя (2G). Как и ожидалось, контрольный штамм не показал никакого нелинейного контраста, тогда как бактерии, экспрессирующие Serratia GV, были обнаружены как в 2D, так и в 3D (2E–2G). NSSM обнаружил нелинейные бактериальные ARG с CNR 27 дБ.
Изображение№3
Также была исследована способность NSSM визуализировать ARG млекопитающих (mARG) в мышиной модели рака. Ортотопические опухоли были вызваны билатерально в жировых отложениях молочной железы самок мышей с ослабленным иммунитетом путем инъекции раковых клеток, сконструированных для создания нелинейно рассеивающих GV (3A). Экспрессия mARG in vivo была вызвана инъекциями доксициклина каждый день до 4-го или 8-го дня. Опухоли были визуализированы на 4-й день после индукции у 3 мышей и на 8-й день после индукции у 2 мышей.
В то время как SSM визуализация выявила анатомические структуры, включая опухолевые массы, NSSM успешно выявил пространственные паттерны экспрессии mARG в этих опухолевых массах (3B). На 8-й день после индукции NSSM выявил некротическое ядро опухолей молочной железы через отсутствие экспрессии генов. Высокая специфичность NSSM, которая устойчива к артефактам нелинейного распространения волн, была ключевой для этого экспериментального наблюдения. Объемная визуализация позволила отобразить поперечные сечения экспрессии mARG в плоскости XY, называемые C-сканированием (правая колонка на 3B). Опухоли были четко обнаружены на обеих стадиях, но некротические ядра были видны только на 8-й день после индукции.
Объемный NSSM, объединенный с анатомической SSM визуализацией, представлен на 3C. Общий сканированный объем простирается на 8.8 х 8.8 х 9 мм2 и был получен с шагом сканирования 55 мкм вдоль каждого массива RCA-преобразователя. На 3C показаны поперечные сечения экспрессии генов в плоскостях XZ, YZ и XY, иллюстрирующие возможности трехмерной навигации NSSM. Количественная оценка объемов опухолевых и некротических ядер была выполнена с помощью автоматического конвейера сегментации (3D). На 4-й день после индукции объемы, измеренные с некротическими ядрами и без них, были схожи, тогда как на 8-й день после индукции объемы, измеренные с некротическими ядрами и без них, показали статистически значимую разницу. Представительная автоматическая сегментация контуров экспрессии генов опухоли представлена на 3D. В этом примере визуализации глубоких тканей, учитывая статическую природу экспрессии генов при использованной скорости визуализации, 2D NSSM работал со скоростью 930 кадров/с, тогда как ортогонально сканированный объемный NSSM работал со скоростью 4 объема/с. Однако в теории 3D NSSM может достигать 94 объемов/с для этого набора параметров визуализации. Интересно, что количественная оценка объемов опухолей in vivo была бы невозможна на основе только анатомической ультразвуковой визуализации, что подчеркивает потенциал этого метода визуализации.
Изображение №4
Наряду с генетически кодируемыми GV, синтетические липидно-оболочечные MB являются еще одним классом ультразвуковых контрастных агентов, используемых в качестве сосудистых репортеров. MB демонстрируют амплитудно-зависимое ультразвуковое рассеяние, что делает их также обнаруживаемыми с помощью последовательностей импульсов амплитудной модуляции. Чтобы проверить способность NSSM визуализировать MB, циркулирующие в кровеносных сосудах, ученые провели высокоскоростную нелинейную допплеровскую визуализацию сосудистой системы мозга крысы (снимки выше).
MB, настроенные на высокочастотный ультразвук, вводились посредством инъекций в хвостовую вену анестезированным крысам с фиксированной головой (4A). В качестве справочного материала линейные допплеровские изображения SSM были получены с частотой кадров 4.4 кГц (4B) и дали результаты, аналогичные сверхбыстрым допплеровским изображениям мозга крысы. Допплеровские изображения NSSM (4C) были получены с использованием амплитудно-модулированных данных и фильтра верхних частот для удаления остаточных статических эхо-сигналов.
Поскольку нелинейная допплеровская обработка пространственно ограничивает данные изображения тонкой звуковой плоскостью размером 100 мкм x 9.6 мм x 8.8 мм, было обнаружено меньше сосудов на 4C, чем на 4B, который проецирует на одно изображение эхо-сигналы, возникающие из косых путей каждой плоской волны (1C). В результате кортикальная поверхность была четко очерчена в допплеровском NSSM (4C), тогда как сосудистые сигналы, проецируемые из косых путей каждой плоской волны, видны над корой на 4B.
Затем ученые провели ультразвуковое секционирование сосудов мозга крысы с субволновыми шагами сканирования 55 мкм (4D), получив четыре последовательных допплеровских сбора данных на плоскость. Была проведена количественная оценка сосудистых изменений в этих смежных плоскостях путем вычисления значения матрицы индекса структурного сходства для каждого допплеровского сбора данных (4E). Внутри наборов индекс структурного сходства в среднем составил 0.99. Это указывает на то, что сосудистые изображения были почти идентичными на протяжении сердечных циклов. Между наборами индекс снизился до 0.96. Это подтвердило, что наблюдались две отдельные сосудистые плоскости.
Вдохновленные методами многослойной томографии, ученые проверили способность допплеровской NSSM захватывать несколько видов мозга одновременно. Для этого ученые чередовали передачу импульсной последовательности с использованием двух субапертур элементов массива (4F). В этой конфигурации частота визуализации была установлена на 1.7 кГц в обеих плоскостях звукового листа. Чтобы продемонстрировать универсальность этого подхода, была проведена визуализация двух коронарных сосудистых плоскостей, разделенных на 3.3 мм, с помощью первой решетки RCA-преобразователя (4G). Аналогичным образом были визуализированы две сагиттальные сосудистые плоскости, разделенные на 3.3 мм, с помощью второй решетки RCA-преобразователя, в результате чего были обнаружены симметричные сосудистые плоскости в каждом полушарии (4H). Наконец, допплеровские спектрограммы SSM в каждой сагиттальной плоскости были обработаны, чтобы показать, что получение данных было непрерывным и совпадало во времени (4I–4J). Частота сердечных сокращений, полученная с помощью допплерографии, составила 298 и 295 ударов в минуту в каждом полушарии мозга соответственно.
В 2015 году ультразвуковое исследование сосудов было переопределено введением ультразвуковой локализационной микроскопии (ULM от ultrasound localization microscopy), метода сверхвысокого разрешения, который может отображать микрососуды in vivo с разрешением ~λ/8. Недостатком текущей обработки ULM является то, что фильтры на основе SVD, используемые для выделения эхосигналов MB, не способны обнаруживать самые медленные скорости кровотока, происходящие в капиллярных руслах. Как следствие, ULM пока не может визуализировать капилляры, хотя это самая обширная сосудистая территория живых организмов. Поскольку обнаружение MB с помощью NSSM основано на нелинейном рассеянии MB, а не на движении MB, ученые выдвинули гипотезу, что сочетание NSSM и ULM может потенциально выявить капиллярные русла in vivo.
Изображение №5
Ученые исследовали нелинейную локализационную микроскопию звукового листа (NSSLM от nonlinear sound-sheet localization microscopy) церебральной капиллярной сосудистой системы (снимки выше). Краниотомированные мозги крыс, перфузируемые MB, визуализировались на частоте 1 кГц с использованием NSSM в коронарной средней мозговой плоскости в течение 105 секунд, что привело к получению 105 кадров (5A). Для генерации современных изображений ULM и изображений NSSLM использовались два конвейера постобработки. Вкратце, обработка NSSLM состояла в фильтрации эхо-сигналов MB с шагом амплитудной модуляции в NSSM, за которой следовала фильтрация по скорости для изоляции MB в нескольких скоростных диапазонах [0-3], [3-15], [15-150] мм/с. Положение отдельных эхо-сигналов MB оценивалось с помощью алгоритма радиальной симметрии, а траектории реконструировались с помощью спаривания Куна-Мункреса. На 5B показаны изображения доплера SSM и NSSM, отфильтрованные в диапазоне скорости капиллярного потока (от 0.5 до 3 мм/с), показывающие, что NSSM извлекает сосудистые сигналы в корковых и гиппокампальных областях мозга крысы с хорошим SNR, тогда как изображения SSM в основном заполнены диффузным сосудистым шумом. В частности, низкие скорости, расположенные на стенке синусной вены, видны в допплеровском NSSM. Временные ряды кадров NSSM, отфильтрованных в диапазоне скорости капиллярного потока (5C), показывают динамику медленно текущих MB, захваченных с помощью NSSM, что составляет основу для постобработки NSSLM. Отдельные микропузырьки, которые являются квазистатичными, обозначены белыми стрелками. В течение 75 мс несколько MB продвигаются менее чем на половину длины волны (57 мкм). Это указывает на то, что их скорость ниже 0.8 мм/с, что попадает в диапазон скоростей капиллярного потока.
В качестве справочного материала ученые обработали современную карту плотности ULM с использованием передачи TX1 последовательности NSSM (5D). Для сравнения, NSSLM (5E–5F) позволил картировать капиллярные русла, сегментированные с полосой скорости потока 0-3 мм/с (левая панель на 5E), артериолы и венулы, сегментированные с полосой скорости потока 3-15 мм/с (средняя панель на 5E) и артерии и вены, сегментированные с полосой скорости потока 15-150 мм/с (правая панель на 5E). Составное изображение NSSLM, показывающее все сосудистые отсеки, представлено на 5F. Сосудистые структуры, отображенные на изображении NSSLM, выглядят явно плотнее структур, обнаруженных с помощью SSLM, как и ожидалось от капиллярных русел.
Для более детального ознакомления с нюансами исследования рекомендую заглянуть в доклад ученых и дополнительные материалы к нему.
Эпилог
В рассмотренном нами сегодня труде ученые продемонстрировали новый метод визуализации сосудов, объединяющий в себе микроскопию и ультразвуковое исследование.
Одним из наиболее распространенных методов диагностики является УЗИ (ультразвуковое исследование), однако он обладает рядом ограничений. В частности, мелкие структуры (например, клетки или даже сосудистые капилляры) не поддаются такой визуализации.
Разработанная учеными система использует звукоотращающий зонд, который представляет собой заполненную газом наноразмерную везикулу (микропузырьки), которая светится на ультразвуковых снимках, делая клетки видимыми. Эти везикулы имеют белковую оболочку, а потому ученые могут спроектировать их так, чтобы они настраивали свою яркость на снимках. Данные микропузырьки использовались для визуализации раковых клеток. Дополнительно микропузырьки использовались для визуализации капиллярной сосудистой структуры мозга крысы, что позволило получить детальную карту капилляров.
Ученые считают, что их разработка может быть полезна не только в рамках клинической диагностики, но и в исследованиях рака. Данная технология позволяет отличить здоровую ткань от раковой, визуализировать некротическое ядро — центр опухоли, где клетки начинают умирать из-за недостатка кислорода. Следовательно, данный метод может быть полезен в отслеживании прогрессирования рака и динамики реакции на препараты.
Немного рекламы
Спасибо, что остаётесь с нами. Вам нравятся наши статьи? Хотите видеть больше интересных материалов? Поддержите нас, оформив заказ или порекомендовав знакомым, облачные VPS для разработчиков от $4.99, уникальный аналог entry-level серверов, который был придуман нами для Вас: Вся правда о VPS (KVM) E5-2697 v3 (6 Cores) 10GB DDR4 480GB SSD 1Gbps от $19 или как правильно делить сервер? (доступны варианты с RAID1 и RAID10, до 24 ядер и до 40GB DDR4).
Dell R730xd в 2 раза дешевле в дата-центре Maincubes Tier IV в Амстердаме? Только у нас 2 х Intel TetraDeca-Core Xeon 2x E5-2697v3 2.6GHz 14C 64GB DDR4 4x960GB SSD 1Gbps 100 ТВ от $199 в Нидерландах! Dell R420 — 2x E5-2430 2.2Ghz 6C 128GB DDR3 2x960GB SSD 1Gbps 100TB — от $99! Читайте о том Как построить инфраструктуру корп. класса c применением серверов Dell R730xd Е5-2650 v4 стоимостью 9000 евро за копейки?
Автор: Dmytro_Kikot
